高效液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)詳解！

一：高效液相色譜法概述

高效液相色譜法(HPLC)是上個(gè)世紀(jì)七十年代迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高效、快速的分析分離技術(shù)，是現(xiàn)代分離測試的重要手段。色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時(shí)，由于與固定相(station phase)發(fā)生作用(吸附、分配、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

HPLC是在經(jīng)典的液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，其以液體作為流動(dòng)相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。其分離機(jī)制與常規(guī)柱色譜相同，但填料更加精細(xì)，需高壓泵推動(dòng)，柱效高，分析速度快。與氣相色譜不同的是液相色譜中流動(dòng)相亦參與組分的分離過程，其組成、比例和pH值可靈活調(diào)節(jié)，分離模式多樣。在實(shí)際操作中主要通過改變流動(dòng)相的組成來調(diào)節(jié)樣品在色譜柱的保留值和選擇性，從而使不同樣品得到分離。

高效液相色譜法自20世紀(jì)60年代問世以來，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的高速、高效和高靈敏度的分離測定。高效液相色譜由于吸取了經(jīng)典液相色譜的研制經(jīng)驗(yàn)，并引入微處理機(jī)技術(shù)，極大的提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度?，F(xiàn)在用微處理機(jī)控制的高效液相色譜儀，其自動(dòng)化程度很高，既能控制儀器的操作參數(shù)(如溶劑梯度洗脫、流動(dòng)相流量、柱溫、自動(dòng)進(jìn)樣、洗脫液收集、檢測器功能等)，又能對(duì)獲得的色譜圖進(jìn)行收縮、放大、疊加，以及對(duì)保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進(jìn)行處理等，為色譜分析工作者提供了高效率、功能齊全的分析工具。

高效液相色譜法的應(yīng)用范圍十分廣泛，對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，幾乎所有的化合物包括高沸點(diǎn)、極性、離子型化合物和大分子物質(zhì)均可用高效液相色譜法分析測定，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20% ，而80% 則需用高效液相色譜來分析。HPLC因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析和分離高沸點(diǎn)且不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物及臨床分析，世界各國己將該法收載于藥典。

火焰離子化檢測器、手性、化學(xué)發(fā)光、核磁共振、質(zhì)譜檢測器等新型檢測技術(shù)

由于HPLC分析不受溫度和樣品沸點(diǎn)限制，因此具有更廣闊的應(yīng)用潛力。經(jīng)過30多年的迅速發(fā)展，高效液相色譜法在基礎(chǔ)理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究已趨于成熟，現(xiàn)已成為化學(xué)化工、環(huán)境、藥學(xué)、食品等多個(gè)領(lǐng)域中具優(yōu)勢的分離分析方法之一。

二：基本原理

液相色譜根據(jù)分離機(jī)理的不同可分為：

¬液固吸附色譜

¬液液分配色譜

¬離子交換色譜

¬離子對(duì)色譜法

¬分子排阻色譜(或凝膠滲透色譜)

(一)液-固吸附色譜

流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑，根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來分離物質(zhì)。

(二)液-液分配色譜

流動(dòng)相和固定相都是液體的色譜法即為液-液色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來進(jìn)行分離。一種液相為流動(dòng)相，另一種是涂于載體上的固定相。

流動(dòng)相極性小于固定相極性的液-液色譜法稱為正相分配色譜法。

流動(dòng)相極性大于固定相極性的液-液色譜法稱為反相分配色譜法。

(三)離子交換色譜

(四)離子對(duì)色譜法

(五)分子排阻色譜法

三：常見故障和維護(hù)

3.1 HPLC對(duì)流動(dòng)相的一般要求

流動(dòng)相就比如人體的血液，其質(zhì)量直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行與否。

應(yīng)該使用HPLC級(jí)的溶劑，不能互相混溶的溶劑不可以直接切換!一般在水相和與其不混溶的溶劑切換時(shí)，使用異丙醇作為過渡溶劑。

注意溶劑的截止波長。截止波長是指該溶劑可以在紫外檢測器中使用的低波長，低于該波長后，溶劑會(huì)有很強(qiáng)的紫外吸收，從而影響極限的穩(wěn)定性、干擾對(duì)所分析物質(zhì)的檢測。

HPLC所使用的水必須是新鮮的和經(jīng)過0.45μm濾膜過濾過的。建議每天更換新鮮的水。長期不用時(shí)，必須把使用水的管路用有機(jī)溶劑置換，防止長霉。

儀器使用完后要采用適當(dāng)?shù)娜軇_洗等方法維護(hù)色譜柱和系統(tǒng)。如果使用了緩沖鹽一定先將鹽要沖洗干凈。

儀器長期不用時(shí)，不建議使用純乙腈封存。因?yàn)橐译嬗猩删酆衔锏内厔荨＝ㄗh使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。

當(dāng)有流路堵塞時(shí)，可以嘗試將之反接后沖洗。污染的溶劑或溶劑瓶里的藻類生長將會(huì)縮短溶劑過濾器的使用壽命，并且影響泵和系統(tǒng)的的性能。這在水溶劑或磷酸鹽緩沖液(pH 4 至7) 中尤其如此。

3.1.1 過濾器

•檢查溶劑過濾器

查看過濾器是否變色(尤其是盛放水相的溶劑瓶)–擰開脫氣機(jī)出口或比例閥入口管線，此時(shí)溶劑會(huì)因?yàn)橹亓α鞒?。?dāng)脫氣機(jī)或溶劑過濾頭堵塞時(shí)，溶劑會(huì)流出不暢或不流出–臨時(shí)取下過濾器，檢查柱前壓力是否正常。

•清潔溶劑過濾器

將堵塞的溶劑過濾器從瓶頭組件中拿下，用水沖洗殘留之溶劑，然后將過濾器放在裝有濃(35%左右)的燒杯里浸一小時(shí)。用二次蒸餾水徹底沖洗過濾器至水為中性可以把過濾器放在塑料燒杯內(nèi)超聲清洗。但是不可使用玻璃器皿將過濾器重新裝好。

•建議：定期清洗溶劑過濾器及溶劑瓶(可以高溫滅菌)，每三個(gè)月至少清洗一次。

3.1.2 泵的使用要點(diǎn)

?將裝有溶劑瓶的溶劑箱放在泵上面或較高處。當(dāng)在四元泵上使用鹽溶液或有機(jī)溶劑時(shí)，建議將鹽溶液接在下面的梯度閥口上，將有機(jī)溶劑接在上面的梯度閥口上，有機(jī)溶劑通道好在水或鹽溶液通道的正上面。建議用水定期沖洗所有MCGV通道除去可能在閥口析出的鹽結(jié)晶。

?操作泵之前，用至少兩個(gè)體積(標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)30mL，對(duì)微脫氣機(jī)10mL)沖洗真空脫氣機(jī)，特別是當(dāng)泵關(guān)閉了一段時(shí)間后(例如，過夜)，以及在通道中使用揮發(fā)性混合溶劑時(shí)，防止溶劑瓶內(nèi)的玻璃濾頭(過濾器)堵塞及長菌，當(dāng)濾頭表面有黑色或黃色污染層說明發(fā)生了堵塞，應(yīng)立即清洗或更換。

?定期檢查排液閥的過濾白頭。檢查方法：擰開排液閥，以水作流動(dòng)相。

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)脫氣機(jī)(G1322A)，流速5ml/min水，若壓力大于10bar，則建議更換。

對(duì)于微量脫氣機(jī)(G1379A)，流速2ml/min水，若壓力大于5bar，則建議更換。

?當(dāng)使用低流速時(shí)，檢查所有1/16英寸接頭有無滲漏(用壓力測試或漏液測試。每當(dāng)更換泵密封墊時(shí)排液閥慮芯也應(yīng)更換。

?更換活塞密封墊時(shí)檢查活塞桿上是否有劃痕。有劃痕的活塞將導(dǎo)致輕度滲漏，并降低密封墊的使用壽命。應(yīng)盡早更換有劃痕的活塞。

?使用緩沖溶液時(shí)，關(guān)泵前先用水沖洗系統(tǒng)。當(dāng)需要長時(shí)間使 用0.1摩爾或更高濃度的緩沖液時(shí)，好選用密封墊清洗附件，以減少對(duì)密封墊及活塞桿的磨損。

?如果使用了高濃度的緩沖鹽，可以考慮用熱水(50-60℃)來沖洗鹽通道來確保沒有緩沖鹽殘留在系統(tǒng)中。

?更換活塞密封墊后應(yīng)按照密封墊安裝步驟對(duì)其進(jìn)行磨合，但磨合不適用于正相密封墊。

?當(dāng)泵頭安裝有柱塞清洗附件時(shí)，由于該附件中也有密封墊，這樣就會(huì)增加活塞桿運(yùn)動(dòng)時(shí)的阻力。所以開泵前一定要用10%異丙醇，并將其流速調(diào)至約2-3滴/分鐘使溶液流過沖洗裝置。(對(duì)于二元泵SL，如果不使用鹽溶液可以不開)10%異丙醇有助于降低水的表面張力，并有抑菌作用。不要用其它溶劑代替。

?當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件而不開啟10%異丙醇，會(huì)使密封墊及活塞桿的壽命減短(二元泵SL除外)，泵頭如果發(fā)出“吱吱”聲不影響使用和泵的精度如果有必要，可以改變壓縮因子(compressibility)來達(dá)到更好的效果。

3.1.3 自動(dòng)進(jìn)樣器

樣品在進(jìn)樣前必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)先處理，需要經(jīng)過亞微米濾膜的過濾或者離心，防止樣品中的微小顆粒堵塞管路，好使用流動(dòng)相作為溶劑配制樣品，所用溶劑應(yīng)該對(duì)樣品有較好的溶解性。

針座是喇叭口朝上暴露在空氣中的，有時(shí)空氣中的較大灰塵顆?？赡芮『寐湓卺樧牧髀穬?nèi)而引起針座的堵塞。這時(shí)候可以嘗試卸下針座，將它接在泵的出口上反沖，一般能解決問題。

如果經(jīng)常使用緩沖溶液，除了泵頭之外，ALS計(jì)量泵的柱塞及密封圈，六通閥的轉(zhuǎn)子密封圈和定子密封圈應(yīng)該定期清洗，防止有鹽的顆粒磨損ALS一定要使用Agilent的樣品瓶及瓶蓋;使用不兼容的或者加工精度差的樣品瓶及瓶蓋會(huì)引起ALS故障率的增加及性能的降低。